消毒效果检查方法及评价指标

正确答案：

1．压力蒸气灭菌效果评价方法与标准
(1)试剂：蛋白胨、葡萄糖、溴甲酚紫酒精溶液（溴甲酚紫2 .0g，溶于100ml95%乙醇中） 。溴甲酚紫蛋白胨水培养基：蛋白胨10 .0g，葡萄糖5．0g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH值至7 .0~7 .2，然后再加2％溴甲酚紫酒精溶液0 .6ml，摇匀后 。按5ml/管，分装包口，置压力蒸气灭菌器中，于115℃灭菌40min 。所用试剂均为分析纯(AR)，水为蒸馏水 。
(2)指示菌：嗜热脂肪杆菌芽胞（ATCC 7953或SSI K31）菌片，含菌量为5×10~5×10cfu/片，121℃下，杀灭90%微生物所需时间D值为1 .3～1 .9min，杀灭时间(KT值)为≤19min，存活时间（ST值）为≥3 .9min 。
(3)化学指示剂需用卫生部批准的化学指示剂 。
(4)检测方法
1)生物学指标：生物学指标是压力蒸气灭菌设备灭菌效果的依据 。将嗜热脂肪杆菌芽胞菌片两个分别放入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位 。
灭菌柜室内，上、中层中央和排气口处各放置一个标准试验包（由3件平纹长袖手术衣，4块小手术巾，2块中手术巾，1块大手术巾，30块10cm×10cm8层纱布敷料包裹成25cm×30cm×30cm) 。手提压力蒸气灭菌器用通气贮物盒(22cm×13cm×6cm)代替标准试验包，盒内盛满中试管，指示菌片放于中心部位两只灭菌试管内（试管口用灭菌牛皮纸包封），将盒平放于手提压力蒸气灭菌器底部 。
经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，56C培养48h，观察培养基颜色变化 。
2)化学指标：在物品包外用化学指示胶带，可作为物品是否经过灭菌的处理标志 。在物品包内中心部位用化学指示剂，可作为物品是否灭菌的参考标志 。
(5)结果判定及评价
1)同次检测中，标准试验包或通气贮物盒内，每个指示菌片接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基全部不变色，判定为灭菌合格 。指示菌片之一接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基由紫色变为黄色时，判定为灭菌不合格 。
2)化学指示剂的颜色变为与灭菌合格标准色相同时，或熔化时作为灭菌合格的参考标准 。
2．紫外线表面消毒效果评价方法与标准(1)指示菌：大肠杆菌（8099或ATCC 25922）；枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC9372) 。
(2)物理学指标：在电压220V时，普通30W直管型紫外线灯，在室温为20~25℃的使用情况下，253 .7nm紫外线辐射强度（垂直1m处）应≥70μW/cm 。
在电压220V时，高强度紫外线灯，在室温为20~25C的使用情况下，253 .7nm紫外线辐射强度（垂直1m处）应≥200μW／cm 。
照射剂量计算：
剂量(μW．S／cm)=强度（μW／cm）×时间(s)
(3)检测方法
1)理学检测方法：灯管的紫外线强度（μW．s/cm）用中心波长为253 .7nm的紫外线强度测定仪，在灯管垂直位置1m处测定 。在实际应用中消毒表面的照射强度应以灯管与消毒对象的实际距离测定 。
表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需 。对大肠杆菌，照射剂量应达到20000μW．s／cm．对枯草杆菌黑色变种芽胞应达到100000μW．S／cm 。
2)生物学检测方法：采用载体定量消毒试验 。开启紫外线灯5min后，将8个染菌玻片平放于灭菌器皿中，水平放于适当距离照射，于4个不同间隔时间各取出2个染菌玻片，分别投入2个盛有5ml洗脱液（1%吐温80，1％蛋白胨生理盐水）试管中，振打80次 。经适当稀释后，取0 .5ml洗脱液，作平板倾注，每个染菌玻片接种两个，放37℃培养48h做活菌计数 。
阳性对照，除不作照射处理外，取2个染菌玻片分别投入2个盛有5ml洗脱液中振打80次 。计算杀灭率 。
(4)判定标准：对指示菌杀灭率≥99 .9%判为消毒合格 。达物理学检测标准时，作为消毒合格的参考标准 。
3．液体消毒剂消毒效果评价方法与标准
(1)理化指标：将消毒剂置(20±2)℃水浴中，测定在使用浓度下杀灭指示微生物达到消毒或灭菌所需的最短时间(min) 。
(2)指示微生物
1)细菌：①细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(8099或ATCC25922)；②细菌芽胞：枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC 9732) 。
2)真菌：白色念珠菌(ATCC 10231) 。
3)乙型肝炎表面抗原：纯化抗原(1．0mg／ml) 。(3)检测方法
1)中和试验 。
2)消毒剂定性消毒试验 。
3)消毒剂定量消毒试验 。
4)消毒剂杀菌能量试验 。
5)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原性破坏试验 。
(4)消毒效果评价标准
1)对细菌和真菌的杀灭率≥99 .9%，对HBsAg，将检测方法灵敏度104倍或5×10倍（载体试验）的HBsAg抗原性破坏，可判为消毒合格 。
2)对枯草杆菌黑色变种芽胞全部杀灭，可判为灭菌合格 。
3)在实际应用中消毒效果评价以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为该消毒剂达到实用消毒所需的浓度和时间 。

解析：

1．压力蒸气灭菌效果评价方法与标准
(1)试剂：蛋白胨、葡萄糖、溴甲酚紫酒精溶液（溴甲酚紫2 .0g，溶于100ml95%乙醇中） 。溴甲酚紫蛋白胨水培养基：蛋白胨10 .0g，葡萄糖5．0g，溶于1000ml蒸馏水中，调pH值至7 .0~7 .2，然后再加2％溴甲酚紫酒精溶液0 .6ml，摇匀后 。按5ml/管，分装包口，置压力蒸气灭菌器中，于115℃灭菌40min 。所用试剂均为分析纯(AR)，水为蒸馏水 。
(2)指示菌：嗜热脂肪杆菌芽胞（ATCC 7953或SSI K31）菌片，含菌量为5×10~5×10cfu/片，121℃下，杀灭90%微生物所需时间D值为1 .3～1 .9min，杀灭时间(KT值)为≤19min，存活时间（ST值）为≥3 .9min 。
(3)化学指示剂需用卫生部批准的化学指示剂 。
(4)检测方法
1)生物学指标：生物学指标是压力蒸气灭菌设备灭菌效果的依据 。将嗜热脂肪杆菌芽胞菌片两个分别放入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位 。
灭菌柜室内，上、中层中央和排气口处各放置一个标准试验包（由3件平纹长袖手术衣，4块小手术巾，2块中手术巾，1块大手术巾，30块10cm×10cm8层纱布敷料包裹成25cm×30cm×30cm) 。手提压力蒸气灭菌器用通气贮物盒(22cm×13cm×6cm)代替标准试验包，盒内盛满中试管，指示菌片放于中心部位两只灭菌试管内（试管口用灭菌牛皮纸包封），将盒平放于手提压力蒸气灭菌器底部 。
经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，56C培养48h，观察培养基颜色变化 。
2)化学指标：在物品包外用化学指示胶带，可作为物品是否经过灭菌的处理标志 。在物品包内中心部位用化学指示剂，可作为物品是否灭菌的参考标志 。
(5)结果判定及评价
1)同次检测中，标准试验包或通气贮物盒内，每个指示菌片接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基全部不变色，判定为灭菌合格 。指示菌片之一接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基由紫色变为黄色时，判定为灭菌不合格 。
2)化学指示剂的颜色变为与灭菌合格标准色相同时，或熔化时作为灭菌合格的参考标准 。
2．紫外线表面消毒效果评价方法与标准(1)指示菌：大肠杆菌（8099或ATCC 25922）；枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC9372) 。
(2)物理学指标：在电压220V时，普通30W直管型紫外线灯，在室温为20~25℃的使用情况下，253 .7nm紫外线辐射强度（垂直1m处）应≥70μW/cm 。
在电压220V时，高强度紫外线灯，在室温为20~25C的使用情况下，253 .7nm紫外线辐射强度（垂直1m处）应≥200μW／cm 。
照射剂量计算：
剂量(μW．S／cm)=强度（μW／cm）×时间(s)
(3)检测方法
1)理学检测方法：灯管的紫外线强度（μW．s/cm）用中心波长为253 .7nm的紫外线强度测定仪，在灯管垂直位置1m处测定 。在实际应用中消毒表面的照射强度应以灯管与消毒对象的实际距离测定 。
表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需 。对大肠杆菌，照射剂量应达到20000μW．s／cm．对枯草杆菌黑色变种芽胞应达到100000μW．S／cm 。
2)生物学检测方法：采用载体定量消毒试验 。开启紫外线灯5min后，将8个染菌玻片平放于灭菌器皿中，水平放于适当距离照射，于4个不同间隔时间各取出2个染菌玻片，分别投入2个盛有5ml洗脱液（1%吐温80，1％蛋白胨生理盐水）试管中，振打80次 。经适当稀释后，取0 .5ml洗脱液，作平板倾注，每个染菌玻片接种两个，放37℃培养48h做活菌计数 。
阳性对照，除不作照射处理外，取2个染菌玻片分别投入2个盛有5ml洗脱液中振打80次 。计算杀灭率 。
(4)判定标准：对指示菌杀灭率≥99 .9%判为消毒合格 。达物理学检测标准时，作为消毒合格的参考标准 。
3．液体消毒剂消毒效果评价方法与标准
(1)理化指标：将消毒剂置(20±2)℃水浴中，测定在使用浓度下杀灭指示微生物达到消毒或灭菌所需的最短时间(min) 。
(2)指示微生物
1)细菌：①细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(8099或ATCC25922)；②细菌芽胞：枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC 9732) 。
2)真菌：白色念珠菌(ATCC 10231) 。
3)乙型肝炎表面抗原：纯化抗原(1．0mg／ml) 。(3)检测方法
1)中和试验 。
2)消毒剂定性消毒试验 。
3)消毒剂定量消毒试验 。
4)消毒剂杀菌能量试验 。
5)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原性破坏试验 。
(4)消毒效果评价标准
1)对细菌和真菌的杀灭率≥99 .9%，对HBsAg，将检测方法灵敏度104倍或5×10倍（载体试验）的HBsAg抗原性破坏，可判为消毒合格 。
2)对枯草杆菌黑色变种芽胞全部杀灭，可判为灭菌合格 。
3)在实际应用中消毒效果评价以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为该消毒剂达到实用消毒所需的浓度和时间 。