简述蛋白质混合物的分离方法简介

正确答案： 可根据蛋白质分子的大小、溶解度、电荷性质与数量、吸附性质及对其它分子的亲和力不同，对蛋白质混合物进行分离。
（1）根据蛋白质的分子大小进行分离
①透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质进行分离，常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸等。
②超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，通过施加压力或离心方法，强行使水和其它小溶质分子通过半透膜，而使蛋白质分子留在半透膜上。
③密度梯度离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，还决定于它的密度。如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时就会停下来。最终各种蛋白质在离心管（常用塑料的）中被分离成各自独立的区带。分成区带的蛋白质可以在管底刺一小孔放出，并分部收集。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。
④凝胶过滤（又叫分子排阻法、分子筛层析）
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，其原理实际上是一种层析法。 凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，在凝胶珠的内部是多孔的网状结构。经常使用的凝胶有交联葡萄糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。
分子大小不同的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，从而被排阻在凝胶珠之外，而比凝胶网孔小的分子则能自由进出珠内网状结构，这样当蛋白质混合物随着溶剂在层析柱中下行时，分子越小蛋白质的在下行过程中所走的距离越长，下行的速度越慢。结果大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。
（2）根据蛋白质的溶解度进行分离
影响蛋白质溶解度的因素主要有pH值、离子强度（盐浓度）、介电常数、温度等。通过改变上述某些条件，使混合物中某种蛋白质的溶解度发生改变，从而达到分离的目的。
①等电点沉淀法
当蛋白质处在等于其等电点的介质环境中时，蛋白质的净电荷数为0，由于相邻蛋白质分子之间的静电斥力消失而发生沉淀。
利用不同的蛋白质分子具有不同的等电点，且蛋白质在等电点时溶解度最小的原理，控制蛋白质溶液的pH值，使其等于某一蛋白质的等电点，从而实现对该蛋白质的沉淀及分离。这样沉淀下来的蛋白质保持了天然构象，在其非等电点的pH介质环境下能重新溶解。
②蛋白质的盐溶和盐析
中性盐对球状蛋白的溶解度有明显的影响。
盐溶及其机理：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。
盐溶的机理是：蛋白质分子与某种盐类离子结合后，带电表层使蛋白质分子间彼此排斥，同时蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，使蛋白质分子溶解度增加。同样浓度的二价离子的中性盐与单价离子的中性盐相比，两价离子的盐溶效果要大得多。
盐析及其机理：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度增加到足够大时，如中性盐浓度处于饱和或半饱和状态时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来。
盐析的机理是：大量中性盐的加入，使水的活度降低，自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质的极性基团与水分子间的相互作用，破坏了蛋白质分子的水化层。
③有机溶剂分级法：在一定的温度、pH值、离子强度条件下，可通过控制有机溶剂的浓度，达到分离蛋白质的目的。
有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，同时使蛋白质变性，如果先将有机溶剂冷却到-40℃到-60℃，然后在不断搅拌的同时，一滴一滴加入有机溶剂以防局部浓度过高，便可以解决变性问题。
④温度
在一定温度范围内（0-40℃），大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。也有例外，如人的血红蛋白。而温度高于40℃-50℃时，大部分蛋白质开始变性。
（3）根据蛋白质所带电荷数的不同进行分离
①电泳：在外加电场的作用下，带电颗粒（如不处于等电点的蛋白质分子）将向与其电性相反的电极移动，这种现象为电泳。
带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷性质、数量；带电颗粒的大小、形状；电场强度的大小等。
②离子交换层析
以强酸型阳离子交换树脂为例，带正电的蛋白质与树脂交换而被“挂”在树脂上，使其移动速度变慢，这种情况下，蛋白质被洗出的顺序一般为：带负电的蛋白质最先被洗出，带正电的蛋白质最后被洗出。

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